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SuperRT逆轉錄酶(RNase H-)說明書
點擊次數:2450 更新時間:2015-05-18

 SuperRT逆轉錄酶(RNase H-)說明書

 

 

SuperRT Reverse Transcriptase

目錄號:YJ0740

保存條件:-20℃保存。

組分說明

 

              Cat. No.                YJ0740       YJ0740A

              Kit Size                   25           100

              SuperRT,200 U/μl          25 μl       100 μl

              5×RT Buffer              120 μl       500 μl

 

本產品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途  

 

 

產品簡介

 

  SuperRT逆轉錄酶是一種利用大腸桿菌工程菌進行重組與表達的全新逆轉錄

酶。與Moloney鼠白血病病毒來源的M-MLV和鳥成髓細胞病毒來源的  AMV不同,該酶

不具有RNase H活性,能夠轉錄多種 RNA模板,可利用極低量的總RNA或mRNA

合成cDNA*鏈,起始樣本量可低至pg級,zui大限度將RNA逆轉錄成cDNA*鏈。

SuperRT逆轉錄酶與RNA親合能力強,能通讀GC含量高,二級結構復雜的RNA模板,獲

得高產量的cDNA。該酶耐熱性及穩(wěn)定性強,操作簡單快速,可以合成   100bp-12kb的

cDNA。適用于*鏈cDNA的合成、RT-PCR、RT-qPCR以及全長cDNA文庫的構建等。

 

活性定義

 

  以Poly(A)為模板,oligo(dT)為引物,在  37℃條件下,10分鐘內催化摻入  1

nmol的dTTP所需酶量定義為一個活性單位(U)。

 

質量控制

 

  200 U的本酶和1  μg的16 S,23 S  rRNA在37℃下反應1小時,RNA的電泳譜帶不

發(fā)生變化。

 

注意事項

 

1.在操作過程中應避免RNase污染,防止RNA降解或實驗中的交叉污染,建議在專門

   的區(qū)域進行RNA操作,使用專門的儀器和耗材,操作人員帶口罩和一次性手套并經

   常更換手套。

2.實驗盡量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,應使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙

   酯)水溶液在37℃處理12小時,并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用,或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3.本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻,盡量避免起泡,并經短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃,避免反復凍融。

4.若起始RNA的量小于50  ng,建議加入RNA酶抑制劑(RNasin)。本試劑盒并未提

   供,如需要可單獨向本公司訂購,貨號:YJ0596。

 

使用方法

 

注意:1 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應體系,如果總RNA量大于5 μg,請按比例擴大反應體系。i逆轉錄操作步驟:

1.將RNA模板、引物、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并

   置于冰上備用。

2.根據以下表格配制反應體系,總體積為20 μl。

 

試劑             20 μl反應體系             終濃度

dNTP Mix,2.5 mM Each                  4  μl         500 μM Each

Oligo-dT Primer,100 μM

或  Random Primers,50 μM               1  μl

或  Specific Primer ,10 μM

RNA Template                          X  μl          50 pg-5 μg

5×RT Buffer                           4  μl              1×

SuperRT,200 U/μl                      1  μl

 RNase-Free Water                  up to 20  μl

 

    注意:若起始RNA的量小于50 ng,則建議加入RNA酶抑制劑(RNasin)。本試劑盒并未提供,如需要可單獨向本公司訂購,貨號:YJ0596。

 

3.渦旋震蕩混勻,短暫離心,使管壁上的溶液收集到管底。

4.42℃孵育30-50分鐘,85℃孵育5分鐘。反應結束后,短暫離心,置于冰上冷卻。

5.逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應,或置于-20℃長期保存。

 

  ii  若逆轉錄效率低,或RNA模板二級結構復雜、GC含量高時,建議采用以下步驟:

1.將RNA模板、引物、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并

   置于冰上備用。

2.根據以下表格配制反應體系,總體積為15 μl。

 

 試劑                 20 μl反應體系             終濃度

 dNTP Mix,2.5 mM Each                   4  μl         500 μM Each

 Oligo-dT Primer,100 μM

 或  Random Primers,50 μM                1  μl

 或  Specific Primer ,10 μM

 RNA Template                           X  μl          50 pg-5 μg

 RNase-Free Water                   up to 15  μl

 

 

     3.70℃孵育10分鐘,迅速冰浴2分鐘。

     4.短暫離心,使管壁上的溶液收集到管底。

     5.繼續(xù)向以上反應液中加入以下試劑:

 

試劑                  20 μl反應體系                 終濃度

5×RT Buffer            4 μl                              

         注意:若起始RNA的量小于50 ng,則建議加入RNA酶抑制劑(RNasin)。本試劑盒并未提供,

         如需要可單獨向本公司訂購,貨號:YJ0596。

 

     6.輕輕吹打混勻,若反轉錄引物為Oligo-dT  Primer或Specific  Primer時,42℃孵育2分 

        鐘;若反轉錄引物為Random Primers,則25℃孵育10分鐘。

     7.加入1 μl SuperRT(200 U/μl),輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鐘。

     8.85℃孵育5分鐘。反應結束后,短暫離心,置于冰上冷卻。

     9.逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應,或置于-20℃長期保存。

 

     相關產品信息

 

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