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HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)
點(diǎn)擊次數(shù):1073 更新時(shí)間:2015-05-15

   

HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)

  

HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit

HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒

目錄號(hào):YJ0745

保存條件:-20℃保存。

 

組分說(shuō)明

 

           Cat. No.                                   YJ0745

           Kit Size                                      100

           HiFi-MMLV OneStep RT-    PCR EnzymeMix       50 μl

           2×OneStep RT-PCR Buffer                      1.4 ml

           RNase-Free Water                             1 ml

 

 

            本產(chǎn)品僅供科研使用,請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途  

 

 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 

  本試劑盒是專(zhuān)為一步法RT-PCR實(shí)驗(yàn)研制,逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行,

反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需添加試劑,無(wú)需打開(kāi)管蓋,在避免污染的同時(shí)提高了檢測(cè)靈敏度和實(shí)驗(yàn)

效率。本試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動(dòng)   DNA聚合酶,同時(shí)包含適用于逆轉(zhuǎn)錄和

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液和實(shí)驗(yàn)中所必需的反應(yīng)組分。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性

缺失,減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA的降解。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性強(qiáng),可獲得高產(chǎn)

量的cDNA。PCR反應(yīng)使用的快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶具有擴(kuò)增效率高、延伸速度快的優(yōu)

良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時(shí)發(fā)揮zui大功效。使用本試劑盒擴(kuò)增得

到的目的產(chǎn)物3′端附有一個(gè)″A″堿基,可直接用于T/A克隆。

 

注意事項(xiàng)

 

1.在操作過(guò)程中應(yīng)避免RNase污染,防止RNA降解或?qū)嶒?yàn)中的交叉污染,建議在專(zhuān)門(mén)

   的區(qū)域進(jìn)行RNA操作,使用專(zhuān)門(mén)的儀器和耗材,操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)

   常更換手套。

2.實(shí)驗(yàn)盡量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,應(yīng)使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙

   酯)水溶液在37℃處理12小時(shí),并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用,或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實(shí)驗(yàn)中用到的無(wú)菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC

   處理后進(jìn)行高壓滅菌。

3.本試劑盒中的所有試劑使用前請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻,盡量避免起泡,并經(jīng)短暫離心

   后使用。所涉及的酶類(lèi)使用后應(yīng)盡快放回-20℃,避免反復(fù)凍融。

4.本試劑盒必須使用特異性引物,引物的選擇可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇,引物設(shè)計(jì)的好

   壞直接影響到RT-PCR  反應(yīng)的結(jié)果,設(shè)計(jì)引物時(shí)需考慮GC含量,引物長(zhǎng)度,引物

   位置,PCR產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素,建議采用專(zhuān)業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件來(lái)設(shè)計(jì)。

 

使用方法

 

1.將RNA模板、引物、  OneStep RT-PCR  Buffer、OneStep  RT-PCR  EnzymeMix

   和RNase-Free  Water溶解并置于冰上備用。

2.根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系:

 

 試劑                                       25 μl反應(yīng)體系         終濃度

2×One Step RT-PCR Buffer                      12.5 μl          1×

Forward Primer,10 μM                            1 μl         0.4 μM

Reverse Primer,10 μM                            1 μl         0.4 μM

HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix             0.5 μl

RNA Template                                   X μl        10 pg –1 μg

RNase-Free water                            up to 25 μl

 

   注意:引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí),可降低引物濃度,由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

 

3.渦旋震蕩混勻,短暫離心,將溶液收集到管底。

4.將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45℃,將PCR管置于熱循環(huán)儀中,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

   反應(yīng)條件:

 

                  步驟            溫度        時(shí)間

                 反轉(zhuǎn)錄            45℃      30 min

               PCR預(yù)變性           95℃       2 min

                  變性            94℃       30 s

                  退火          55-65℃      30 s    30-40個(gè)循環(huán)

                  延伸            72℃       30 s

                 終延伸            72℃       5 min

 

   注意:1)一般PCR實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時(shí)間一般為20-30秒,無(wú)法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí),適當(dāng)降低退火溫度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí),提高退火溫度,由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

   2)延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增的片段大小設(shè)定,本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴(kuò)增效率為1 kb/30s。

   3)可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少,擴(kuò)增量不足;循環(huán)次數(shù)多,錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加,非特異性背景嚴(yán)重。所以,在保證產(chǎn)物得率的前提下,應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

 

5.反應(yīng)結(jié)束后取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物,加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測(cè)結(jié)果。

 

     相關(guān)產(chǎn)品信息

 

目錄號(hào)               產(chǎn)品名稱(chēng)                                        產(chǎn)品特點(diǎn)

YJ0580   TRIzon總RNA提取試劑                       適用范圍廣的RNA提取試劑

YJ0581 超純RNA提取試劑盒

兼具有適用范圍廣和純度高特點(diǎn)的RNA提取試劑

YJ0597 超純RNA提取試劑盒(含DnaseI)    靈敏度高,可識(shí)別pg級(jí)別的模板。與RNA親和力強(qiáng),

YJ0741   SuperRT cDNA*鏈合成試劑盒

                                                     能夠通讀GC含量高,二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板。

YJ0744   HiFi-MMLV cDNA*鏈合成試劑盒獲得cDNA產(chǎn)物

SuperQuickRT  cDNA*鏈合成試逆轉(zhuǎn)錄(針對(duì)于熒光定量PCR

劑盒(For Real-time PCR))

YJ2381                       僅需15分鐘,即可完成熒光定量PCR所需的cDNA 

                SuperQuickRT MasterMix          即用型逆轉(zhuǎn)錄mix,只需加入RNA和水即可反應(yīng)。僅

YJ2391 

                (for Real-Time PCR)                  需15分鐘,即可完成熒光定量PCR所需的cDNA 

YJ0688   Es Taq DNA Polymerase 

                                           兼具高擴(kuò)增效率和高保真性的PCR產(chǎn)品

YJ0690   Es Taq MasterMix 

YJ0957   UltraSYBR Mixture                      熒光定量PCR—SYBR Green法

YJ0956   UltraSYBR Mixture(With ROX)            特異性強(qiáng)、Ct值低、定量更準(zhǔn)確

 

 

        

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