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SuperRT一步法RT-PCR試劑盒說明書
SuperRT One Step RT-PCR Kit
目錄號：YJ0742
保存條件：-20℃保存。
組分說明
Cat. No. YJ0742
Kit Size 100
SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix 50 μl
2×OneStep RT-PCR Buffer 1.4 ml
RNase-Free Water 1 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡介
本試劑盒是專為一步法RT-PCR實驗研制，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，
反應(yīng)過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗
效率。本試劑盒包括全新逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動DNA聚合酶，同時包含適用于逆轉(zhuǎn)
錄和PCR擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液和實驗中所必需的其它組分。SuperRT逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活
性缺失，減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中 RNA的降解。該逆轉(zhuǎn)酶逆轉(zhuǎn)錄效率高，可對少量 RNA模
板進(jìn)行良好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 PCR反應(yīng)使用的快速熱啟動 DNA聚合酶具有擴(kuò)增效率高、
特異性強(qiáng)、延伸速度快的優(yōu)良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時發(fā)揮zui大
功效。使用本試劑盒擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物3′端附有一個″A″堿基，可直接用于T/A克隆。
注意事項
1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒炛械慕徊嫖廴荆ㄗh在專門
的區(qū)域進(jìn)行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)
常更換手套。
2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應(yīng)使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙
酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃
器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC
處理后進(jìn)行高壓滅菌。
3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心
后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃，避免反復(fù)凍融。
4．本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實驗來選擇，引物設(shè)計的好
壞直接影響到RT-PCR 反應(yīng)的結(jié)果，設(shè)計引物時需考慮GC含量，引物長度，引物
位置，PCR產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)等因素，建議采用專業(yè)的引物設(shè)計軟件來設(shè)計。
使用方法
1．將RNA模板、引物、 OneStep RT-PCR Buffer、SuperRT OneStep RT-PCR
EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系：
試劑 25 μl反應(yīng)體系 終濃度
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μl 1×
Forward Primer，10 μM 1 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 μM 1 μl 0.4 μM
SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix 0.5 μl
RNA Template X μl 1 pg – 1 μg
RNase-Free water up to 25 μl
注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
4．將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45℃，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
反應(yīng)條件：
步驟 溫度 時間
反轉(zhuǎn)錄 45℃ 30 min
PCR預(yù)變性 95℃ 2 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個循環(huán)
延伸 72℃ 30 s
終延伸 72℃ 5 min
注意：1）一般PCR實驗中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為20-30秒，無法得到理想的擴(kuò)增效率時，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
2）延伸時間根據(jù)擴(kuò)增的片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴(kuò)增效率為1 kb/30s。
3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；循環(huán)次數(shù)多，錯配機(jī)率會增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
5．反應(yīng)結(jié)束后取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測結(jié)果。
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