植物RNA提取試劑盒說明書
RNApure Plant Kit
Cat. No. K0588
保存:室溫
組分說明
Catalog no. | K0588 |
Kit Size | 50 |
Buffer RL | 35 ml |
Buffer RLC | 35 ml |
Buffer RW1 | 40 ml |
BufferRW2(concentrate) | 11 ml |
RNase-Free Water | 10 ml |
Shredder Spin Column | 50 |
Spin Column RM | 50 |
Collection Tube(1.5 ml) | 50 |
Collection Tube(2 ml) | 100 |
產(chǎn)品簡介
本試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質(zhì)總 RNA,也適用于真菌菌絲 RNA 的提取。*的 Shredder 分離柱,用于勻質(zhì)化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物,同時采用硅基質(zhì)膜吸附 RNA 進行純化,使多聚糖等各種污染物通過洗滌被有效去除,經(jīng)洗脫的 RNA 可直接用于各種下游實驗。由本試劑盒提取 RNA 分子量大于 200 堿基,純度高,幾乎無 DNA 殘留。如果是對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實驗,殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase I 在柱上進行消化去除。提取的RNA 可用于 Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR 和體外翻譯等實驗。
注意事項
1. 預防RNase污染,應注意以下幾方面:
1)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。
2)玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。
3)配制溶液應使用無RNase的水。
4)操作人員戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套。
2. 提取的樣品避免反復凍融,否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。
3. Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇,至終濃度為 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer RL 室溫可保存 1 個月。Buffer RLC 使用時不需加β-巰基乙醇。
4. 第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。
5. Buffer RL 和 Buffer RLC 如果產(chǎn)生沉淀,請加熱使其溶解后室溫放置。
6. 所有離心步驟若無特殊說明均在室溫下進行,且所有操作步驟動作要迅速。
7. 若下游實驗對 DNA 非常敏感,建議用不含 RNase 的 DNase I(貨號:YJ2090A)對 RNA 進行處理。
自備試劑:β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)
操作步驟
1. 取植物新鮮組織50-100 mg,加入液氮迅速研磨成粉末。
2. 將研磨后的粉末收集到離心管(自備)中,加入600 μl Buffer RL(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇)或Buffer RLC,渦旋振蕩使其充分裂解。
注意:1)Buffer RL主要成分為異硫氰酸胍,適用于大多數(shù)植物組織的裂解。但有些植物組織(如玉米的胚乳),由于次級代謝產(chǎn)物較特殊,異硫氰酸胍使樣品產(chǎn)生沉淀,導致RNA提取效果不佳,此時可加入Buffer RLC替代Buffer RL。
2)56℃孵育1-3分鐘有助于組織的裂解,但是淀粉含量高的植物不要進行高溫孵育。
3. 將步驟2所得全部液體轉(zhuǎn)移至已裝入收集管(Collection Tube 2 ml)的過濾柱(Shredder Spin Column)中,12,000rpm(~13,400×g)離心2分鐘,將收集管中的上清液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管(自備)中。
注意:1)在吸取液體時可以將槍頭尖端剪掉,便于取樣。
2)Shredder Spin Column可以除去大部分的碎片,但仍會有小部分流出,離心后會在收集管內(nèi)形成沉淀,在進行下一步時注意避免吸到沉淀。
4. 在步驟3所得干凈的裂解液中加入0.5倍體積的無水乙醇,迅速混勻。
注意:加入乙醇后可能會產(chǎn)生沉淀,但不影響后續(xù)試驗。
5.
將步驟4得到的溶液全部加入到已裝入收集管(Collection Tube 2 ml)的吸附柱(Spin Column RM)中,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中,請分兩次轉(zhuǎn)入。10,000 rpm(~11,500×g)離心15秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
6. 向吸附柱中加入700 μl Buffer RW1,10,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
可選步驟:如果要進行對微量DNA非常敏感的RNA實驗,則用以下步驟替代步驟6。
1)向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
2)配制DNase I 混合液:取52 μl RNase-Free Water,向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I(1 U/μl),混勻, 配制成終體積為80 μl 的DNase I混合液。
注意: 以上體系為按照我公司產(chǎn)品DNase I (K2090A)反應體系進行配置,應用其他公司產(chǎn)品請參考相應說明書。
3)向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液,20-30℃孵育15分鐘。
4)向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
7. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇), 10,000 rpm離心15秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
8. 重復步驟7。
9. 12,000 rpm離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘,以*晾干。
注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除,乙醇殘留會影響后續(xù)的酶促反應(酶切、PCR等)。
10. 將吸附柱置于一個新的無RNase離心管(Collection Tube 1.5 ml)中,向吸附柱的中間部位懸空加入30-50 μl RNase-Free Water,室溫放置1分鐘,10,000 rpm離心1分鐘,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。
注意:1) RNase-Free Water 體積不應小于 30 μl,體積過小影響回收率。
2) 如果要提高RNA的產(chǎn)量,可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟10。
3) 如果要提高RNA濃度,可將得到的溶液重新加入到吸附柱中,重復步驟10。
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