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EF21A\J1                      2016-01版

孔雀石綠

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物孔雀石綠將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物孔雀石綠的含量。

二、試劑盒特性

1. 試劑盒靈敏度：   0.05ppb
2. 孵育溫度：       25℃
3. 孵育時間：       30min～30min～15min
4. 樣本檢測限

水樣      ·······································  0.1ppb

水產(chǎn)品    ·······································  0.5ppb    

1. 交叉反應(yīng)率

顯性孔雀石綠  ·································   100%

隱性孔雀石綠  ································    0.1%

結(jié) 晶 紫    ····································    95%

隱性結(jié)晶紫  ··································     0.1%

1. 樣本回收率

水樣、水產(chǎn)品  ····························  80%~110%

1. 精密度

板內(nèi)、板間變異系數(shù)≤12%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙腈、二氯甲烷、無水硫酸鈉、正己烷

五、樣本前處理步驟

1. 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

1. 樣本前處理需配制：

配液1 樣品提取液  

       乙腈-二氯甲烷混合溶液：

         V_乙腈-V_二氯甲烷  =  4 : 1， 取40ml乙腈，

      再加入10ml二氯甲烷，混勻后使用。

配液2 樣品復(fù)溶液

    將4X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：3稀釋

   （1份4×濃縮復(fù)溶液+3份去離子水），或按所

    需用量配制。

1. 樣本處理：

• 水樣處理方法

   取50µl清澈水樣樣直接測定（如果水樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min，直至得到清澈樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

• 水產(chǎn)品處理方法

1. 稱取2±0.05g均質(zhì)組織樣品于50ml離心管中，加入6ml樣品提取液（配液1），2g無水硫酸鈉，振蕩5min ，室溫（25℃左右）4000r/min以上離心10min；
2. 取3ml上清液，加入20µl氧化劑，搖勻，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；
3. 加入1ml正己烷，加入1ml樣品復(fù)溶液（配液2），振蕩搖勻1min，4000r/min以上離心5min；
4. 取下層50 µl用于分析；

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

注：此方法所得到的結(jié)果為孔雀石綠；隱性孔雀石綠；結(jié)晶紫；隱性結(jié)晶紫的總量。

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

1. 測定前應(yīng)須知：

1. 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3. 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4. 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

1. 操作步驟：

1. 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3. 配液1：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液2：

配制孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液：取一定量的10倍濃縮

標(biāo)準(zhǔn)液用樣品復(fù)溶液10倍稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用，

具體如下：

    標(biāo)準(zhǔn)液6：配制4.05ppb標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 40.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻；

    標(biāo)準(zhǔn)液5：配制1.35ppb標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 13.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻；

    標(biāo)準(zhǔn)液4：配制0.45ppb標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 4.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液3：配制0.15ppb標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 1.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液2：配制0.05ppb標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 0.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液1：配制 0ppb標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 0ppb標(biāo)

         準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻；

1. 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
2. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
3. 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
4. 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
5. 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
6. 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含孔雀石綠量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.05ppb為1.816；0.15ppb為1.415；

0.45ppb為0.74；1.35ppb為0.313；4.05ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb～4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項

1. 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4. 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6. 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7. 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8. 該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1. 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2. 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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